MEA助力心脏毒理研究---系列二

      MEA可以检测到所有参与电生理反应的通道，而不是只有单个离子通道。所以能够被用来定义特定离子通道或者受体与药物互作所引起的的细胞整体特征性反应。在这个版块里，我们会进一步地通过实验探索这个概念。用来处理细胞的药物包括快速钠离子通道阻断剂、hERG抑制剂和β-肾上腺素受体激动剂这三种，然后会用MEA系统来分析细胞反应的电信号。

      河豚毒素是一种有效的钠离子阻断剂。它对于心脏快速钠离子通道Nav1.5作用的IC50浓度范围在1-2个2μM。从上图的MEA场电位连续波形图上可以看出，用2μM浓度的药物处理后，iPSC衍生心肌细胞的总体信号强度减弱了。结果符合我们的预期。

      QT间期延长可能会导致TdP（尖端扭转性室速）。这种异常的主要的机理之一就是hERG阻断。

      分析上面的MEA跳动图示，可以看到奎尼丁和E4031这两个药物对T波振幅的抑制作用。这个图形结果还给出了EAD形成的证据，它已被证明和TdP以及心律不齐相关。另外，两种加药组样本的跳动频率也下降了。

      异丙肾上腺素对于T波的幅度没有影响，但是会缩短场电位时长，也就改变了跳动频率。 这表明受测的细胞有效表达了β-肾上腺素G蛋白偶联受体。

      以上这三个案例表明，iPSC衍生心肌细胞与MEA技术联用，将会是一种强大的筛选工具。通过分析急性的药物心脏反应对一系列电生理信号的影响，我们就能了解到其背后的药物作用机理。

      并非所有的药物对于心脏的副作用，都会在急性给药实验中体现出来。将iPSC-CMs和MEA结合为一个平台后，最重要的优势就是能够在体外预测意料之外的风险以及药物的长期慢性作用。由于无需标记且能够长时间地维持细胞存活并实时检测，这项技术很适合在新药开发的初始阶段就药物的短期和长期的风险做出评估。目前，长期研究是在狗的身上遥测完成的，价格不菲。另外，虽然大部分药物是通过直接阻断来作用于hERG通道的，但是人们还发现了其它的药物作用机理，即抑制hERG通道迁移到细胞表面。它可能会导致传统安全评估实验的假阴性结果。在这里，我们将通过一些实验案例，来展示MEA是如何克服这些瓶颈的。

      这是一种杀菌剂，可以作为hERG迁移受到药物影响的案例。在iPSC-CMs样本中加入药物后，持续培养24至48小时。我们使用MEA技术就能检测到hERG的迁移作用。结果显示在下方的跳动图示上，黑色的分组是未加药对照，红、绿、蓝色分别对应药物处理后第2、24及48小时的检测结果。

      我们可以看出两小时内，并未能检出药物的急性作用，MEA结果和对照组是完全一致的。而药物持续作用24小时后，细胞就明显显现出复极延迟和跳动时长的延长，而且复极的信号幅度也有些微下降。到48小时后，药物的作用还会进一步加强。

      这是一种鸟嘌呤核苷的类似物，BMS将它开发成前体药物，用来治疗丙肝病毒。 在二期临床实验中，先是有一名受试病人死亡，而后又有八人因为药物心脏毒性进院治疗。 在这些人身上都观察到了一系列心脏毒副作用，包括ST段压低、T波倒置及其振幅减小。 这样，该药物开发的后续工作就在2012年彻底停止了。 值得注意的是，上述毒性反应在用量提高至200mg时才发生。 而在当时，体外心脏毒性测试无法对更大给药量的影响做出评估。 这恰恰就是该药物二期临床前风险评估失败的主要原因之一。

      后来，我们使用MEA技术，结合iPSC衍生心肌细胞对BMS-986094药物的心脏毒性机理做了研究。图A是从四个电生理参数的角度，记录了336小时（14天）内随着药物浓度增加，细胞反应的变化。表内数值代表加药组结果占未加药组基线值（经过空载体对照校对）的百分比。

      从图A的结果可知，随着时间的推移，药物的毒性会越来越显著直到最终导致细胞停止跳动。而且就算在80 nM这样的高浓度，药物持续作用14天后，我们仍然能观察到跳动频率的显著改变，钠通道信号幅度相比基础值持续增加，并且保持高度一致性。

      图B 是跳动示意图。可以帮着我们了解不同浓度的药物作用下，心肌细胞在跳动时长和T波幅度方面的相应变化，而且可以在相对比较大的时间跨度上进行分析。

      对体外心脏慢性毒性效应评估来说，传统的方法学是第一大阻碍。因为在这些平台上得到的结果曾导致有着很大心脏健康风险的药物未能在新药开发流程的早期被有效识别。从上述案例中可以看到，MEA这种强大的技术平台能够更早更有效地检测到这些风险，从而能够在药物早期开发中起到作用。

      全球人口结构的老龄化，导致包括心血管药物在内的多处方药品联合治疗方案得到越来越广泛的应用。这样药物间相互作用（DDI）导致意外发生的可能性也大大提高了。虽然在体外和临床试验中DDI药代动力学测试已经是常规项目了，但是对药物安全受到基于药效动力学的DDI影响的重视程度却没有那么高。在开展体外高通量药物筛选时，要么是没有做这项实验，要么就是无法检测出DDI。这就意味着只有等药物完成市场准入后，这种风险才会被暴露出来。

      人们观察到心血管药物的DDI作用已经有相当长的一段时间了。MEA技术使得我们能够在药物开发的早期就将其识别出来。而iPSC-CMs具备的综合性表型特征，使得药物的心脏副作用MEA应用，可以从定量评估拓展到机理探索。

      这两种药物在药效动力学DDI的意料之外发现可以作为对心脏安全有影响的案例来供大家探讨。索非布韦一类的药物对于丙型病毒性肝炎病人来说是个莫大的福音。虽然在药物的临床试验中并未发现它对心脏有不利影响，但是上市后却有多起报告显示，它与胺碘酮联用会导致严重的心动过缓病症。虽然这种DDI背后的机理不明，但据猜测是和P-糖蛋白这种多药物转运蛋白互作有关。在下面的实验中，我们使用MEA结合iPSC衍生心肌细胞在体外来重现这种DDI，并初步地测试了该样本作为DDI研究模型的可行性。

       索非布韦+胺碘酮单独或合并处理hiPSC衍生心肌细胞电生理参数变化。

      MEA实验记录到的数据表明，这两种药物的DDI会影响到iPSC衍生心肌细胞的电生理。而这些影响的根源并非是常见的钠、钾、钙电流受到直接阻滞，或者是P-gp药物转运体和代谢产物等相关因素。反而，它们倒是和药物在临床相关浓度下引起的胞内钙调控紊乱有关。并且，当药物浓度达到最高的超生理浓度水平时，还会发生收缩跳动的停滞。

      因此，这些MEA数据说明，这种基于药效动力学的DDI的机理可能会和心脏功能相关。这个结果不但为索非布韦-胺碘酮互作提供了新的机理研究线索，而且说明iPSC-CMs这种综合性的模型系统，有着可被用于DDI评估的可能性。

      有效开展心脏毒理评估是确保新药开发在临床（前）阶段获得成功的重要因素。和注重机理研究的传统电生理技术相比，多孔MEA技术能够在类ECG的综合表型水平开展多因素毒性风险分析。上述案例表明，这种特性支持从短期、长期及药物间互作等多个维度评估候选药物。同时，人源细胞样本的使用，也避免了物种差异给检测结果带来的不确定性。总体而言，这项技术的使用，能在很大程度上提高临床前与临床实验结果的一致性，从而降低药物开发全流程的成本与风险。